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  • BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用
BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用 授权有效中;
  • 专利(申请)号: CN202111087455.8
  • 专利类型: 发明;
  • 主分类: C化学、冶金;
  • 产业领域: 家蚕蛋白酶抑制剂
  • 专利来源: 高校;
  • 申请日: 2021-09-16
  • 申请人: 陕西理工大学
  • 当前专利权人: 陕西理工大学
  • 交易方式: 转让; 许可; 其他;
  • 其他交易方式: 产学研
  • 参考价格(元): ¥面议
  • 联系方式: 运营平台029-65666507/29

陕西理工大学生物科学与工程学院李游山副教授团队家蚕蛋白酶抑制剂技术

陕西理工大学生物科学与工程学院李游山副教授团队家蚕蛋白酶抑制剂技术

李游山,博士,副教授,硕导,汉中市青年科技领军人才,国家自然科学基金项目通讯评审专家,陕西省农作物品种审定委员会桑蚕专业委员会专家委员,陕西省“三区”科技人才,中国蚕学会会员,中国细胞生物学学会会员,西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心陕西校友会会长。其带领的“先进构型材料多尺度行为创新团队”“秦巴昆虫多样性与资源化利用创新团队”成功入选陕西高校青年创新团队。主持国家自然科学基金青年项目(31702187)、陕西省自然科学基础研究计划重点项目(2022JZ-12)、陕西省教育厅重点科学研究计划项目(22JY017)、国家重点实验室开放课题(sklsgb-2019KF04)、陕西理工大学重点培育项目(SLGKYXM2202)等11项,参与国家自然科学基金等各类项目8项;发表论文40余篇,其中SCI收录14篇,其中top期刊论文8篇;授权中国国家发明专利9项,申请美国发明专利2项;获汉中市第十一届自然科学优秀学术论文奖二等奖。

陕西理工大学生物科学与工程学院起源于1958年成立的汉中大学农学系,是学校最早设立的院系之一。经过60余载的历史传承和深厚积淀,2006年学校正式成立生物科学与工程学院。学院拥有一支具有开阔视野与竞争力的教师队伍,承担着教书育人、科研创新与服务社会的使命与重任。现有教职工84人,教学科研人员72人,具有高级职称50人,博士学位54人,有“双聘院士”1人,省级教学名师1人,“汉江学者”16人,陕西省“三秦人才”津贴享受者5人;陕西省中小企业首席工程师9人,省级科技特派员30余人。现有省级教学团队2个,省级科技创新团队1个,三秦学者创新团队2个,陕西省“特支计划”4人。学院依托良好的科研条件和技术支撑平台开展科学研究,重点围绕茶资源、中药材、食药用菌资源等陕南绿色食药资源开发与利用领域取得了一系列科研成果,科研创新能力不断提高。近年来,学院获批国家级、省部级等各级各类项目189项,发表论文811篇,其中被SCI收录175篇。出版专著及教材12部,发明专利20项。获省部级科研奖13项。

《家蚕抗性因子BmSPI38和BmSPI39在丝蛋白合成和贮存中的功能研究》

BmSPI38突变体的社会推广价值主要体现在其对人类健康、环境保护和可持续发展的潜在贡献。如果该突变体能够用于开发新药,那么它将可能对公共健康产生重要影响,此外,如果该突变体能够提高农作物产量,那么它将可能有助于解决食品安全和饥饿问题,因此专利技术具有广泛的市场前景和推广应用价值。在未来,随着生物科学技术的进步和纳米医学的发展,BmSPI39的同型串联多聚体在药物递送、生物传感器等领域的应用将更加广泛,主要技术优势在于本专利独特的单元模块构建和算法优化。

摘要

【 中文摘要 】本发明涉及多聚体构建技术领域,具体公开了BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用,通过设计并合成串联多聚体引物BmSPI38‑Nde I‑BamH I‑F、BmSPI38‑Not I‑R、BmSPI38‑Bgl II‑R和BmSPI38‑L‑Bgl II‑R,以BmSPI38‑p28为模板扩增获得目的基因片段,利用同尾酶法设计并构建了BmSPI38同型串联多聚体载体,再通过转化、诱导表达、纯化获得BmSPI38同型串联多聚体。本发明获得的BmSPI38同型串联多聚体能够成功抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K的活性,且活性更强,表达形式更为均一。

【 英文摘要 】The invention relates to the technical field of multimer construction, specifically discloses a homotype tandem polymer of BmSPI38 as well as a construction method and an application thereof. The method comprises the following steps of : designing and synthesizing tandem multimer primers BmSPI38-Nde I-BamH I-F, BmSPI38-Not I-R, BmSPI38-Bgl II-R and BmSPI38-L-Bgl II-R; amplifying by using BmSPI38-p28 as a template to obtain a target gene fragment; designing and constructing a BmSPI38 homotype tandem multimer vector by using a homotailase method; and converting, inducing expression and purifying to obtain the BmSPI38 homotype tandem multimer. The BmSPI38 homotype tandem polymer obtained by the invention can successfully inhibit the activities of subtilisin and protease K, and is stronger in activity and more uniform in expression form.

技术摘要(来自于incoPat)

【 DWPI用途 】

BMSPI38的同种型串联多聚体用于预防真菌(要求保护)。

【 DWPI优势 】

本发明的BMSPI38同种型串联聚合物能够成功抑制枯草杆菌蛋白酶,蛋白酶K的活性,具有较强的活性,表达形式均一。

【 DWPI新颖性 】

1.BmSPI38的同型串联多聚体的构建,包括 : (S1)设计并合成串联多聚体引物,以BmSPI38-P28为模板扩增得到目的基因片段,回收目的片段并与T载体连接,转化感受态细胞,培养,过滤阳性克隆; (S2)将NdeI/BamHI-SPI38-notI从T载体上切下,连接到p28载体上,构建BmSPI38单体表达载体; S3)用同尾酶法设计构建BmSPI38同型串联多聚体的表达载体; S4)将获得的BmSPI38单体表达载体和BmSPI38同型串联多聚体表达载体转入大肠杆菌,诱导表达,收集菌体,将菌体超声破碎,离心,获得表达BmSPI38单体蛋白和BmSPI38同型串联多聚体蛋白的菌体上清,纯化。

【 DWPI详细描述 】

1.BMSPI38的同型串联多聚体的构建, 包括: (S1)设计并合成串联多聚体引物BmSPI38-NdeI-BamHI-F, BMSPI38-不是I-R, BMSPI38-BGL II-R和BMSPI38-LBGL II-R, 以BmSPI38-P28为模板扩增得到目的基因片段, 回收靶片段并与T载体连接后,转移感受态细胞,培养后,过滤阳性克隆,分别为NdeI/BamHI-spI38-notI,NdeI/BamHI-spI38-BGLII,NdeI/BamHIspI38L-BGLII; 当引物BmSPI38-ndeI-BamHI-F包含说明书中给出的39个碱基对的全限定序列(SEQ ID NO.1)时,引物BmSPI38-notIR包含说明书中给出的33个碱基对的全限定序列(SEQ ID NO.2); 引物BmSPI38-BGLⅡ-R包含如说明书中所述的序列5′-GAAGATCTGCAATCAGAATGGGCACAT-3′(SEQ ID NO.3),引物BmSPI38-BGLⅡ-包含如说明书中所述的完全限定的序列75个碱基对(SEQ ID NO.4); (S2)用NdeI和NotI双酶切酶切,从T载体上切下NdeI/BamHI-SPI38-NotI,连接到p28载体上,成功构建BmSPI38单体表达载体; S3)用同尾酶法设计构建BmSPI38同型串联多聚体的表达载体; 其中BmSPI38同型串联多聚体的表达载体包括BmSPI38二聚体,BmSPI38三聚体和BmSPI38四聚体的表达载体; 和(S4)将获得的BmSPI38单体表达载体和BmSPI38同型串联多聚体表达载体转入大肠杆菌, 用异丙基-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导表达,然后离心收集菌体细胞,将菌体细胞超声破碎,离心得到表达BmSPI38单体蛋白和BmSPI38同型串联多聚体蛋白的菌体上清,然后纯化蛋白。

【 DWPI生物活性 】

杀菌剂。

【 DWPI技术要点 】

优选的方法: 在步骤(S2)中, BmSPI38单体表达载体的构建过程具体如下: 用限制性内切酶NdeI和NotI双酶切酶切NdeI/BamHI-SPI38-NotI和p28载体, 在T4连接酶的作用下,获得目的载体NdeI/BamHispI38-notI-p28,即BmSPI38-表达载体,然后将其转化大肠杆菌感受态细胞,培养,提取质粒,获得BmSPI38-质粒,即BmSPI38单体表达载体。 在步骤(S3)中,BmSPI38二聚体表达载体的构建过程为:首先用NdeI,BglII切割酶成功构建重组T载体NdeI/BamHI-SPI38-BglII; NdeI/BamHI-SPI38L-BglⅡ进行双酶切消化,然后用NdeI和BamHI两种酶对BmSPI38-单体进行双酶切消化,再分别用T4DNA连接酶NdeI/BamHI-SPI38-BglⅡ和BmSPI38-; 用BMSPI38-单体连接NdeI/BamHI-SPI38L-BGLⅡ; 将连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞培养,质粒提取,获得BmSPI38-质粒和成功构建的BmSPI38-L-质粒,即BmSPI38串联二聚体的表达载体。 BMSPI38三聚体载体的构建过程具体如下: 使用NDE I, BGLⅡ切割酶克隆到T载体NdeI/BamHI-SPI38-BGLⅡ上, 用于双酶切消化的NdeI/BamHI-SPI38L-BglⅡ, 然后用NdeI和BamHI两种酶对构建成功的BmSPI38-二聚体和BmSPI38-L-二聚体进行双酶切消化, 然后用T4DNA连接酶分别将带有BmSPI38-二聚体的NdeI/BamHI-SPI38-BGLⅡ和NdeI/BamHI-SPI38L-BGLⅡ与BmSPI38-L-单体连接; 将产物连接到大肠杆菌感受态细胞上,培养,提取质粒,得到BmSPI38-三聚体质粒和由两个BmSPI38三聚体载体成功构建的BmSPI38-三聚体质粒的BmSPI38-L-三聚体质粒。 BmSPI38四聚体载体的构建过程具体如下: 使用NDE I, 将BGLⅡ核酸内切酶克隆到T载体NdeI/BamHispI38-BGLⅡ上, 用于双酶切消化的NdeI/BamHI-SPI38L-BglⅡ, 然后用NdeI和BamHI两种酶对构建成功的BmSPI38-三聚体和BmSPI38-L-三聚体进行双酶切消化, 然后用T4DNA连接酶分别NdeI/BamHI-SPI38-BGLⅡ与BmSPI38-三聚体, 和NdeI/BamHI-SPI38L-BglⅡ和BmSPI38-L-三聚体,将产物与大肠杆菌感受态细胞连接,培养,质粒抽提,获得成功构建的BmSPI38-四聚体和BmSPI38-L-四聚体两种BmSPI38四聚体载体。 BmSPI38-质粒是不加接头的BmSPI38二聚体载体,BmSPI38-L-质粒是加入接头的BmSPI38二聚体载体,BmSPI38-三聚体质粒是不加接头的BmSPI38三聚体载体,BmSPI38-L-三聚体质粒是添加接头的BmSPI38三聚体载体,BmSPI38-四聚体质粒是不含接头的BmSPI38四聚体载体; 所述BmSPI38-L-四聚体质粒为添加接头的BmSPI38四聚体载体。 大肠杆菌为ORIGAMI2(DE3)。 在步骤(S4)中,所述蛋白质纯化方法为镍柱亲和层析纯化。 BMSPI38同型串联多聚体包括BMSPI38单体,BMSPI38同型系列二聚体,BMSPI38同型系列三聚体和BMSPI38同型系列四聚体。

【 用途 】

生物(体)动物组织同种型串联多聚体
真菌真菌

【 技术功效 】

技术功效句且活性更强
技术功效短语活性强
技术功效1级活性
技术功效2级活性提高
技术功效3级活性提高

分类号

【技术分类】

主分类号

C12N15/70;

  • C 化学;冶金

  • C12

    生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程

  • C12N

    微生物或酶;其组合物;繁殖、保藏或维持微生物;变异或遗传工程;培养基(微生物学的试验介质入C12Q1/00)。

  • C12N15/00

    突变或遗传工程;遗传工程涉及的DNA或RNA,载体(如质粒)或其分离、制备或纯化;所使用的宿主(突变体或遗传工程制备的微生物本身入C12N1/00、C12N5/00、C12N7/00;新的植物入A01H;用组织培养技术再生植物入A01H4/00;新的动物入A01K67/00;含有插入活体细胞的遗传物质以治疗遗传疾病的药剂的应用,基因疗法入A61K48/00,一般肽入C07K)[3,5,6,2006.01]

  • *C12N15/09

    DNA重组技术[2006.01]

  • **C12N15/63

    使用载体引入外来遗传物质;载体;其宿主的使用;表达的调节[2006.01]

  • ***C12N15/70

    专门适用于大肠杆菌的载体或表达系统〔5〕

IPC分类号
CPC分类号C12N15/70; C07K14/811; A61P31/10; C07K2319/00; A61K38/00;
DWPI分类号B04; C06; D16;
DWPI手工代码B04-E99; B04-L05A; B04-N0200E; B14-A04; B14-S22; C04-E99; C04-L05A; C04-N0200E; C14-A04; C14-S22; D05-A02C; D05-C12; D05-H17A; D05-H99;

【行业分类】

国民经济行业分类

制造业

国民经济行业(主)

制造业

新兴产业分类

生物医药产业生物农业及相关产业

新兴产业(主)

生物农业及相关产业

知识密集型分类

新装备制造业新材料制造业医药医疗产业

学科分类

生命科学与生物医学物理科学

清洁能源产业

太阳能产业生物质能产业传统能源清洁高效利用产业

清洁生产产业

清洁生产原料制造业

专利历程

  • 2021-09-16

    申请日

    CN202111087455.8(当前专利)

    申请号

  • 2021-12-14

    首次公开日

    CN113789341A

    首次公开号

  • 2022-10-11

    授权公告日

    CN113789341B(当前专利)

    授权公告号

  • 2041-09-16

    预估到期日

    计算因素

代理机构西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙) 61223
代理人崔瑞迎
申请语言汉语
审查员白婧

权利要求

1.BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法,特征在于,包括如下步骤:
S1,设计并合成串联多聚体引物BmSPI38‑Nde I‑BamH I‑F、BmSPI38‑Not I‑R、BmSPI38‑Bgl II‑R和BmSPI38‑L‑Bgl II‑R,以BmSPI38‑p28为模板扩增获得目的基因片段,回收目的片段后与T载体连接,然后转入感受态细胞,培养后筛选阳性克隆,分别记为,Nde I/BamH I‑SPI38‑Not I、NdeI/BamHI‑SPI38‑Bgl Ⅱ、NdeI/BamHI‑SPI38L‑Bgl Ⅱ;
所述引物BmSPI38‑Nde I‑BamH I‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述引物BmSPI38‑Not I‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述引物BmSPI38‑Bgl II‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述引物BmSPI38‑L‑Bgl II‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
S2,利用Nde I和Not I双酶切,将Nde I/BamH I‑SPI38‑Not I从T载体上切下,连接到p28载体上,成功构建BmSPI38单体的表达载体BmSPI38‑monomer;
S3,同尾酶法设计并构建了BmSPI38同型串联多聚体的表达载体;
所述BmSPI38同型串联多聚体的表达载体为:
不加Linker的BmSPI38二聚体载体BmSPI38‑dimer,加Linker的BmSPI38二聚体载体BmSPI38‑L‑dimer,不加Linker的BmSPI38三聚体载体BmSPI38‑trimer,加Linker的BmSPI38三聚体载体BmSPI38‑L‑trimer,不加Linker的BmSPI38四聚体载体BmSPI38‑tetramer,加Linker的BmSPI38四聚体载体BmSPI38‑L‑tetramer;
S4,将获得的BmSPI38单体的表达载体和BmSPI38同型串联多聚体的表达载体转入大肠杆菌中,并利用IPTG对其进行诱导表达,然后通过离心收集菌体,超声破碎菌体细胞,离心获得表达有BmSPI38单体蛋白和BmSPI38同型串联多聚体蛋白的菌体上清,然后进行蛋白纯化,所述蛋白纯化方式为镍柱亲和层析纯化,用400mM咪唑洗脱;
相比于BmSPI38单体,BmSPI38串联多聚体对蛋白酶的抑制活性能力强,均一性好。

2.如权利要求1所述的BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法,特征在于,S2中,所述BmSPI38单体表达载体的构建过程具体为:用限制性核酸内切酶NdeⅠ和NotⅠ对NdeⅠ/BamHⅠ‑SPI38‑NotⅠ以及p28载体进行双酶切,在T4连接酶作用下进行连接,获得目的载体Nde I/BamH I ‑SPI38‑Not I‑p28,即BmSPI38‑monomer表达载体,然后将其转化进大肠杆菌感受态细胞,进行培养、质粒提取,获得构建成功的BmSPI38‑monomer质粒,即BmSPI38单体的表达载体。

3.如权利要求2所述的BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法,特征在于,S3中,所述BmSPI38二聚体表达载体的构建过程具体为:先用Nde I、BglⅡ内切酶对前面构建成功的重组T载体NdeI/BamH I‑SPI38‑BglⅡ、Nde I/BamH I‑SPI38L‑BglⅡ进行双酶切,再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI38‑monomer进行双酶切,然后使用T4 DNA 连接酶分别将NdeI/BamH I‑SPI38‑BglⅡ与BmSPI38‑monomer,以及Nde I/BamH I‑SPI38L‑BglⅡ与BmSPI38‑monomer进行连接,连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞,进行培养、质粒提取,获得构建成功的BmSPI38‑dimer质粒和BmSPI38‑L‑dimer质粒,即为BmSPI38串联二聚体的表达载体。

4.如权利要求3所述的BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法,特征在于,S3中,所述BmSPI38三聚体载体的构建过程具体为:用Nde I、BglⅡ内切酶对克隆在T载体上的NdeI/BamH I‑SPI38‑BglⅡ,Nde I/BamH I‑SPI38L‑BglⅡ进行双酶切,再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI38‑dimer和BmSPI38‑L‑dimer进行双酶切,然后使用T4 DNA 连接酶分别将NdeI/BamH I‑SPI38‑BglⅡ与BmSPI38‑dimer,以及Nde I/BamH I‑SPI38L‑BglⅡ与BmSPI38‑L‑dimer进行连接,连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞,进行培养、质粒提取,获得构建成功的BmSPI38‑trimer质粒和BmSPI38‑L‑trimer质粒两种BmSPI38三聚体载体。

5.如权利要求4所述的BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法,特征在于,S3中,所述BmSPI38四聚体载体的构建过程具体为:用Nde I、BglⅡ内切酶对克隆在T载体上的NdeI/BamH I‑SPI38‑BglⅡ,Nde I/BamH I‑SPI38L‑BglⅡ进行双酶切,再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI38‑trimer和BmSPI38‑L‑trimer进行双酶切,然后使用T4 DNA 连接酶分别将NdeI/BamH I‑SPI38‑BglⅡ与BmSPI38‑trimer,以及Nde I/BamH I‑SPI38L‑BglⅡ与BmSPI38‑L‑trimer进行连接,连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞,进行培养、质粒提取,获得构建成功的BmSPI38‑tetramer和BmSPI38‑L‑tetramer两种BmSPI38四聚体载体。

6.如权利要求5所述的BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法,特征在于,S4中,所述的大肠杆菌为Origami 2(DE3)。

7.由权利要求1‑6任一项所述的BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法制备得到的BmSPI38同型串联多聚体,特征在于,所述BmSPI38同型串联多聚体包括BmSPI38同型串联二聚体、BmSPI38同型串联三聚体和BmSPI38同型串联四聚体。

8.权利要求7所述的BmSPI38的同型串联多聚体在制备抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K的试剂中的应用。

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