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陕西理工大学生物科学与工程学院李游山副教授团队家蚕蛋白酶抑制剂技术
陕西理工大学生物科学与工程学院李游山副教授团队家蚕蛋白酶抑制剂技术
李游山，博士，副教授，硕导，汉中市青年科技领军人才，国家自然科学基金项目通讯评审专家，陕西省农作物品种审定委员会桑蚕专业委员会专家委员，陕西省“三区”科技人才，中国蚕学会会员，中国细胞生物学学会会员，西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心陕西校友会会长。其带领的“先进构型材料多尺度行为创新团队”“秦巴昆虫多样性与资源化利用创新团队”成功入选陕西高校青年创新团队。主持国家自然科学基金青年项目（31702187）、陕西省自然科学基础研究计划重点项目（2022JZ-12）、陕西省教育厅重点科学研究计划项目（22JY017）、国家重点实验室开放课题（sklsgb-2019KF04）、陕西理工大学重点培育项目（SLGKYXM2202）等11项，参与国家自然科学基金等各类项目8项；发表论文40余篇，其中SCI收录14篇，其中top期刊论文8篇；授权中国国家发明专利9项，申请美国发明专利2项；获汉中市第十一届自然科学优秀学术论文奖二等奖。
陕西理工大学生物科学与工程学院起源于1958年成立的汉中大学农学系，是学校最早设立的院系之一。经过60余载的历史传承和深厚积淀，2006年学校正式成立生物科学与工程学院。学院拥有一支具有开阔视野与竞争力的教师队伍，承担着教书育人、科研创新与服务社会的使命与重任。现有教职工84人，教学科研人员72人，具有高级职称50人，博士学位54人，有“双聘院士”1人，省级教学名师1人，“汉江学者”16人，陕西省“三秦人才”津贴享受者5人；陕西省中小企业首席工程师9人，省级科技特派员30余人。现有省级教学团队2个，省级科技创新团队1个，三秦学者创新团队2个，陕西省“特支计划”4人。学院依托良好的科研条件和技术支撑平台开展科学研究，重点围绕茶资源、中药材、食药用菌资源等陕南绿色食药资源开发与利用领域取得了一系列科研成果，科研创新能力不断提高。近年来，学院获批国家级、省部级等各级各类项目189项，发表论文811篇，其中被SCI收录175篇。出版专著及教材12部，发明专利20项。获省部级科研奖13项。
《家蚕抗性因子BmSPI38和BmSPI39在丝蛋白合成和贮存中的功能研究》
BmSPI38突变体的社会推广价值主要体现在其对人类健康、环境保护和可持续发展的潜在贡献。如果该突变体能够用于开发新药，那么它将可能对公共健康产生重要影响，此外，如果该突变体能够提高农作物产量，那么它将可能有助于解决食品安全和饥饿问题,因此专利技术具有广泛的市场前景和推广应用价值。在未来，随着生物科学技术的进步和纳米医学的发展，BmSPI39的同型串联多聚体在药物递送、生物传感器等领域的应用将更加广泛，主要技术优势在于本专利独特的单元模块构建和算法优化。
技术摘要（来自于incoPat）
| 技术功效句 | 且活性更强 |
| 技术功效短语 | 活性强 |
| 技术功效1级 | 活性 |
| 技术功效2级 | 活性提高 |
| 技术功效3级 | 活性提高 |
分类号
| 主分类号 |
|
| IPC分类号 | |
| CPC分类号 | C07K14/81; C12N15/70; A61K38/55; A61P31/10; C07K2319/00; Y02A50/30; |
| DWPI分类号 | A96; B04; C06; D16; |
| DWPI手工代码 | A10-E01; A12-W11L; B04-E99; B04-L05A; B04-L05C0E; B14-A04; B14-D07C; C04-E99; C04-L05A; C04-L05C0E; C14-A04; C14-D07C; D05-A02C; D05-C03C; D05-H17A3; D05-H99; |
| 代理机构 | 西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙) 61223 |
| 代理人 | 崔瑞迎 |
| 申请语言 | 汉语 |
| 审查员 | 关维 |
权利要求
1.BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，设计并合成串联多聚体引物BmSPI39‑Nde I‑BamH I‑F、BmSPI39‑Not I‑R、BmSPI39‑Bgl II‑R和BmSPI39‑L‑Bgl II‑R，以BmSPI39‑p28为模板扩增获得目的基因片段，回收目的片段后与T载体连接，然后转入感受态细胞，培养后筛选阳性克隆，分别记为，NdeI/BamHI‑SPI39‑Not I、NdeI/BamHI‑SPI39‑Bgl Ⅱ、Nde I/BamH I‑SPI39L‑Bgl Ⅱ；
所述引物BmSPI39‑Nde I‑BamH I‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述引物BmSPI39‑Not I‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述引物BmSPI39‑Bgl II‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述引物BmSPI39‑L‑Bgl II‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
S2，利用Nde I和Not I双酶切，将Nde I/BamH I‑SPI39‑Not I从T载体上切下，连接到p28载体上，成功构建BmSPI39单体的表达载体BmSPI39‑monomer；
S3，同尾酶法设计并构建了BmSPI39同型串联多聚体的表达载体；
所述BmSPI39同型串联多聚体的表达载体为：
不加Linker的BmSPI39二聚体载体BmSPI39‑dimer，加Linker的BmSPI39二聚体载体BmSPI39‑L‑dimer，不加Linker的BmSPI39三聚体载体BmSPI39‑trimer，加Linker的BmSPI39三聚体载体BmSPI39‑L‑trimer，不加Linker的BmSPI39四聚体载体BmSPI39‑tetramer，加Linker的BmSPI39四聚体载体BmSPI39‑L‑tetramer；
S4，将获得的BmSPI39单体的表达载体和BmSPI39同型串联多聚体的表达载体转入大肠杆菌中，并利用IPTG对其进行诱导表达，然后通过离心收集菌体、超声破碎菌体细胞，离心获得表达有BmSPI39单体蛋白和BmSPI39同型串联多聚体蛋白的菌体上清，然后进行蛋白纯化，所述蛋白纯化方式为镍柱亲和层析纯化，用400 mM咪唑洗脱；
相比于BmSPI39单体，BmSPI39串联多聚体对蛋白酶的抑制活性能力强，均一性好。
2.如权利要求1所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S2中，所述BmSPI39单体表达载体的构建过程具体为：用限制性核酸内切酶NdeⅠ和NotⅠ分别对NdeⅠ/BamHⅠ‑SPI39‑NotⅠ以及p28载体进行双酶切，在T4连接酶作用下进行连接，获得目的载体Nde I/BamH I ‑SPI39‑Not I‑p28，即BmSPI39‑monomer表达载体，然后将其转化进大肠杆菌感受态细胞，进行培养、质粒提取，获得构建成功的BmSPI39‑monomer质粒，即BmSPI39单体的表达载体。
3.如权利要求2所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S3中，所述BmSPI39二聚体表达载体的构建过程具体为：先用Nde I、BglⅡ内切酶对前面构建成功的重组T载体NdeI/BamH I‑SPI39‑BglⅡ，Nde I/BamH I‑SPI39L‑BglⅡ进行双酶切，再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI39‑monomer进行双酶切，然后使用T4 DNA 连接酶分别将NdeI/BamH I‑SPI39‑BglⅡ与BmSPI39‑monomer以及Nde I/BamH I‑SPI39L‑BglⅡ与BmSPI39‑monomer进行连接，连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，进行培养、质粒提取，获得构建成功的质粒BmSPI39‑dimer和质粒BmSPI39‑L‑dimer，即为BmSPI39串联二聚体的表达载体。
4.如权利要求3所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S3中，所述BmSPI39三聚体载体的构建过程具体为：用Nde I、BglⅡ内切酶对克隆在T载体上的NdeI/BamH I‑SPI39‑BglⅡ，Nde I/BamH I‑SPI39L‑BglⅡ进行双酶切，再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI39‑dimer和BmSPI39‑L‑dimer进行双酶切，然后使用T4 DNA 连接酶分别将NdeI/BamH I‑SPI39‑BglⅡ与BmSPI39‑dimer以及Nde I/BamH I‑SPI39L‑BglⅡ与BmSPI39‑ L‑dimer进行连接，连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，进行培养、质粒提取，获得构建成功的BmSPI39‑trimer质粒和BmSPI39‑L‑trimer质粒两种BmSPI39三聚体载体。
5.如权利要求4所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S3中，所述BmSPI39四聚体载体的构建过程具体为：用Nde I、BglⅡ内切酶对克隆在T载体上的NdeI/BamH I‑SPI39‑BglⅡ，Nde I/BamH I‑SPI39L‑BglⅡ进行双酶切，再使用Nde I和BamH I两种酶对已构建成功的BmSPI39‑trimer和BmSPI39‑L‑trimer进行双酶切，然后使用T4 DNA 连接酶分别将NdeI/BamH I‑SPI39‑BglⅡ与BmSPI39‑trimer以及Nde I/BamH I‑SPI39L‑BglⅡ与BmSPI39‑ L‑trimer进行连接，连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，进行培养、质粒提取，获得构建成功的BmSPI39‑tetramer和BmSPI39‑L‑tetramer载体。
6.如权利要求5所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，S4中，所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。
7.由权利要求1‑6任一项所述的BmSPI39的同型串联多聚体的构建方法制备得到的BmSPI39同型串联多聚体，其特征在于，所述BmSPI39同型串联多聚体包括BmSPI39同型串联二聚体、BmSPI39同型串联三聚体和BmSPI39同型串联四聚体。
8.权利要求7所述的BmSPI39的同型串联多聚体在制备抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K的试剂中的应用。
